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细菌内毒素检验的标准有哪些?
阅读:121    时间:2019-06-18
细菌内毒素检查法是利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素,以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
1.医疗器械细菌内毒素检验标准
(1)GB/T 14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分:生物学试验方法;
(2)2015年版《中国药典》1143 细菌内毒素检查法。
2.医疗器械细菌内毒素所需主要设备
(1)电热干燥箱,温度达到 250 ℃,用于除外源性内毒素。
(2)旋涡混合器。
(3)试管恒温仪、恒温水浴箱或适宜的恒温器,可设定温度为(37±1)℃。
(4)天平,精度为 0.1 mg 以下。
(5)鲎试剂,应具有国家主管部门的批准文号。
(6)细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品,应具有国家主管部门的批准文号。
(7)细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准,其内毒素含量小于0.015EU/ml(用于凝胶法)或0.005 EU/ml(用于光度测定法),且对内毒素试验无干扰作用。
(8)实验用具:剪刀、砂轮、试管、三角瓶、试管架、洗耳球、封口膜、75% 乙醇棉、时钟、移液管(或刻度吸管)、凝集管(10 mm×75 mm)、微量加样器及无热原吸头。耐热器皿须经250℃干烤至少30min。若使用与微量加样器配套的吸头等塑料器具时,应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。
3.试验准备
3.1 玻璃器皿的洗涤
将玻璃器皿放入铬酸洗液中充分浸泡,然后取出将洗液控干,用自来水将残留洗液彻底洗净,再用蒸馏水反复冲洗3 遍以上,控干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内,放入电热干燥箱。
3.2  除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素
玻璃器皿置电热干燥箱后,待干燥箱温度升至250 ℃后开始计时,干烤30 min以上。达到规定时间后,关断电源,待干燥箱温度自然降至室温。
3.3 供试品溶液的制备
供试品应使用细菌内毒素检查用水为浸提介质,一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的 pH值为6.0~8.0为宜。采用无热原氢氧化钠或盐酸溶液调节供试液的pH值。无热原氢氧化钠或盐酸溶液须用细菌内毒素检查用水,在已去除内毒素的容器中配制。也可使用不含内毒素和干扰因子且经过验证的缓冲液。
4.凝胶法操作方法
利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝聚反应的机制,以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。如经检验证实供试品对细菌内毒素试验有不能排除的干扰作用则不适宜采用本试验。本试验操作过程应防止内毒素的污染。
4.1鲎试剂灵敏度复核
在使用一批新的鲎试剂进行供试品细菌内毒素检查或供试品干扰试验前,实验室必须进行鲎试剂灵敏度复核试验。目的为考察鲎试剂的灵敏度是否准确,同时也考查检验人员操作方法是否正确及试验条件是否符合规定。
4.1.1细菌内毒素标准溶液的制备(按说明书,略)
4.1.2 待复核鲎试剂的准备(按说明书,略)
4.1.3 加样(按说明书,略)
4.1.4观察并记录结果
将试管架从水浴或恒温器中轻轻取出,避免振动,将每管拿出缓缓倒转 180°观察,若管内形成凝胶,并且凝胶不变形,不从管壁滑脱者为阳性,记录为(+);未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性,记录为(-)。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
4.1.5 试验结果计算
4.1.6 结果判断
当λc 在 0.5~2.0 λ(包括 0.5 λ 和 2.0 λ)时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格,可用于干扰试验和供试品细菌内毒素检查,并以λ(标示灵敏度)为该批鲎试剂的灵敏度。
4.1.7 举例
4.2干扰试验
目的是检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。
4.3供试品细菌内毒素检查[3-4]
在细菌内毒素检查中,每批供试品必须做2支供试品管和2支供试品阳性对照,同时每次试验须做2支阳性对照和2支阴性对照。
注意事项
(1)试验前,须用肥皂洗手,用75%乙醇棉球消毒,试验操作应在清洁环境中进行,过程中应防止内毒素的污染。
(2)在使用洗耳球、移液管取样时,应注意不要将洗耳球中的气体吹入溶液中,以防止气体中的内毒素进入供试液。
(3)试验所用器具经250℃干烤30min以上,要待烤箱温度升至250℃后开始计时。在不打开金属容器的情况下,可在2d内使用;如果玻璃器皿用锡箔纸包装,在不打开包装的情况下可在两周内使用,否则须再次干烤。
(4)开启细菌内毒素国家标准品或工作标准品、鲎试剂时,先轻弹瓶壁,使粉末落入瓶底,然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕,75%乙醇棉球擦拭后启开,启开过程中应防止玻璃碎片落入瓶内。
(5)无菌医疗器械生产企业在生产过程中须严格控制产品初始污染菌,以免导致灭菌后产品细菌内毒素指标超过限值。
(6)对于非液态产品企业制定产品技术要求时,如按EU/ml规定细菌内毒素限值在试验方法中则需明确产品的浸提液体积。
(7)按GB/T14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法第 2部分:生物学试验方法进行供试品细菌内毒素检验时,供试液应在(37±1)℃恒温箱中浸提不小于 1h,供试液贮存应不超过2h。
(8)溶解鲎试剂及混匀供试品和鲎试剂时,不要剧烈振荡避免产生气泡;试验过程中应注意更换吸头,以避免检查用水的污染及溶液的交叉污染。
(9)由于凝集反应是不可逆的,所以在反应过程中及观察结果时应注意不要使试管受到振动,以免使凝胶破碎产生假阴性结果。
(10)进行干扰试验时,标准对照系列和含内毒素的供试品溶液系列应同时进行;如经检验证实供试品对细菌内毒素试验有不能排除的干扰作用则不适宜采用凝胶限度法。
(11)在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰试验和供试品细菌内毒素检查时,各个试验中要求的对照应同时进行,并在试验有效的情况才能进行计算和判断。
(12)对于一个初包装内有多组件的成套器械,如规定的内毒素限值是针对成套器械的,可以用一份浸提液对所有组件浸提,也可将各组件分别浸提后混合,各组件所用的浸提液总体积应不超过MVD,当组合后样品出现结果不确定时,则需分别检验各组件,以研究各组件的污染源。
(13)如一个初包装产品为多个医疗产品的集合,在临床应用中每种医疗器械独立使用,则应有各自的产品内毒素限值,且应分别进行试验和评价。

(14)2015年版《中国药典》1143细菌内毒素检查法包括凝胶法和光度测定法,后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时,可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时,除另有规定外,以凝胶限度试验结果为准。 

 
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